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Aug 21, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11506 (2023) Citar este artículo

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La rápida naturalización de Bombus terrestris en la península de Nemuro ha provocado una disminución de dos especies japonesas nativas estrechamente relacionadas, a saber, Bombus hipócrita sapporensis y Bombus cryptarum florilegus, ambas pertenecientes al subgénero común Bombus. Aunque se cree ampliamente que el cruce de especies nativas y no nativas está influenciado por la feromona sexual masculina común en esta región, no se ha realizado ningún estudio para fundamentar esta afirmación. Por lo tanto, investigamos las actividades cruzadas de las feromonas sexuales masculinas entre abejorros nativos y no nativos, así como las frecuencias de apareamiento cruzado, utilizando ensayos químicos y de ADN. Nuestros análisis de cromatografía de gases y detectores electroantenográficos y pruebas de comportamiento revelaron la presencia de actividades cruzadas de feromonas sexuales entre B. terrestris y las dos especies de abejorros japoneses. Además, los análisis de ADN revelaron la aparición de cruces entre especies nativas y no nativas en la península de Nemuro. En general, estos resultados indican la necesidad inmediata de medidas de conservación para salvaguardar las poblaciones de abejorros japoneses en la península de Nemuro.

Desde su designación como especie exótica en Japón en 2006, el abejorro importado Bombus terrestris L. ha planteado importantes desafíos. Aunque B. terrestris actúa como un importante polinizador de invernadero, las reinas y los machos que escaparon han establecido poblaciones salvajes en Hokkaido, Japón. Este proceso de naturalización ha llevado a la competencia entre B. terrestris y las especies nativas de abejorros japoneses, la interrupción de las relaciones simbióticas entre las plantas nativas y los abejorros y la introducción de nuevas plagas y patógenos1,2,3,4,5,6,7,8 .

En condiciones de laboratorio, la hibridación entre B. terrestris y especies de abejorros japoneses estrechamente relacionadas, como B. hipócrita hipócrita, B. h. sapporensis y B. ignitus se presentan fácilmente9. Sin embargo, no se producen híbridos viables cuando las reinas nativas se aparean con machos de B. terrestris, ya que los huevos puestos cesan el desarrollo embrionario10,11. Sin embargo, el cruzamiento entre estas especies tiene efectos perjudiciales sobre la reproducción de los abejorros nativos, ya que las reinas Bombus normalmente se aparean sólo una o dos veces12. Además, análisis de ADN previos revelaron la presencia de espermatozoides de B. terrestris en las espermatecas de reinas salvajes de B. h. hipócrita, B. h. sapporensis y B. ignitus, lo que indica que el apareamiento cruzado entre machos de B. terrestris y reinas nativas ocurre en el campo11. Nuestro estudio anterior también sugirió que el apareamiento cruzado se ve facilitado por las similitudes en la producción de feromonas sexuales masculinas en la glándula labial (LG)13.

La península de Nemuro, situada en el este de Hokkaido, representa un hábitat valioso para los abejorros nativos, con 10 de 15 especies japonesas, incluida la rara especie de abejorro B. cryptarum florilegus, que prosperan en esta región14. De hecho, B. c. florilegus exhibe una distribución restringida, ocurriendo sólo en las penínsulas de Nemuro y Notsuke en Japón, y está catalogada como una especie casi amenazada en la Lista Roja de Japón14. Dado que B. terrestris se ha naturalizado en esta región, las poblaciones de B. h. sapporensis y B. c. florilegus han ido disminuyendo constantemente15. Aunque se cree ampliamente que el cruce entre especies nativas y no nativas está influenciado por la feromona sexual masculina común en la región, no hay evidencia empírica que respalde esta hipótesis. Por lo tanto, utilizando ensayos químicos y de ADN, investigamos las frecuencias de apareamiento cruzado y las actividades cruzadas de las feromonas sexuales masculinas entre abejorros nativos y no nativos.

Los análisis previos de cromatografía de gases y detector electroantenográfico (GC-EAD) confirmaron la presencia de dodecanoato de etilo, 2,3-dihidrofarnesal y 2,3-dihidrofarnesol emitidos por el LG macho en B. terrestris16. Además, se ha detectado dodecanoato de etilo en el LG macho de B. h. sapporensis13. Nuestros análisis GC-EAD confirmaron que el LG masculino de B. c. florilegus emite dodecanoato de etilo. Además, el dodecanoato de etilo y el 2,3-dihidrofarnesol provocaron respuestas antenales electrofisiológicas claras en reinas vírgenes de B. terrestris (Fig. 1Aa). Sin embargo, sólo el dodecanoato de etilo provocó respuestas antenales electrofisiológicas claras en B. h. sapporensis y B. c. reinas vírgenes florilegus (Fig. 1Ab,Ac,Ba,Bb,Bc,Ca,Cb,Cc).

Registros simultáneos de cromatografía de gases, detector de ionización de llama y detector electroantenográfico de (a) Bombus terrestris, (b) B. hipócrita sapporensis y (c) B. cryptarum florilegus reinas vírgenes utilizando volátiles recolectados de la glándula labial masculina (LG) de (A ) B. terrestris, (B) B. h. sapporensis y (C) B. c. florilegus. Compuestos identificados: (1) dodecanoato de etilo; (2) 2,3-dihidrofarnesal; y (3) 2,3-dihidrofarnesol.

El análisis binomial de las pruebas de comportamiento realizadas utilizando un olfatómetro de tubo en Y reveló que las reinas de B. terrestris (n = 20) mostraron una preferencia significativa (P < 0,05) por BtL (P = 0,000067), BhsL (P = 0,023103), BcfL ( P = 0,044357), ED (P = 0,00109), DF (P = 0,000067) y EFM (P = 0,000067) sobre pentano (Fig. 2). De manera similar, basándose en el análisis de la prueba binomial, B. h. Las reinas sapporensis exhibieron una preferencia significativa (P < 0,05) por BtL (P = 0,041656, n = 15), BhsL (P = 0,000214, n = 15), BcfL (P = 0,000366, n = 14), ED (P = 0,001221). , n = 12) y EFM (P = 0,034912, n = 13) sobre pentano (Fig. 3). Asimismo, el análisis de la prueba binomial reveló que B. c. Las reinas florilegus (n = 10) mostraron una preferencia significativa (P < 0,05) por BtL (P = 0,017578), BhsL (P = 0,006836), BcfL (P = 0,006836), ED (P = 0,006836) y EFM (P = 0,043945) sobre pentano (Fig. 4). Sin embargo, ni B. h. sapporensis (n = 11) ni B. c. Las reinas florilegus (n = 10) exhibieron atracción o repulsión hacia el DF en comparación con el pentano (prueba binomial, P = 0,225586 y P = 0,246094, respectivamente) (Figs. 3 y 4). Además, B. terrestris (n = 20), B. h. sapporensis (n = 15) y B. c. Las reinas florilegus (n = 10) no mostraron atracción ni repulsión hacia el pentano en comparación con un control vacío (prueba binomial, P = 0,160179, P = 0,196381 y P = 0,205078, respectivamente) (Figs. 2, 3 y 4).

Atractivo de los aromas de extractos de glándulas labiales (LG) de Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) y B. c. florilegus (BcfL), así como dodecanoato de etilo (ED), 2,3-dihidrofarnesol (DF) y una mezcla de dodecanoato de etilo y 2,3-dihidrofarnesol (EFM), frente al disolvente pentano (Pe) y un control vacío (E) en reinas vírgenes Bombus terrestris. El eje y indica el número de individuos que eligen cada aroma en 5 minutos. Los asteriscos indican significación estadística (P < 0,05) determinada mediante pruebas binomiales.

Atractivo de los aromas de extractos de glándulas labiales (LG) de Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) y B. c. florilegus (BcfL), así como dodecanoato de etilo (ED), 2,3-dihidrofarnesol (DF) y una mezcla de dodecanoato de etilo y 2,3-dihidrofarnesol (EFM), frente al disolvente pentano (Pe) y un control vacío (E) en B. h. Reinas vírgenes sapporensis. El eje y indica el número de individuos que eligen cualquiera de los aromas en 5 minutos. Los asteriscos indican significación estadística (P < 0,05) determinada mediante pruebas binomiales.

Atractivo de los aromas de extractos de glándulas labiales (LG) de Bombus terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL) y B. c. florilegus (BcfL), así como dodecanoato de etilo (ED), 2,3-dihidrofarnesol (DF) y una mezcla de dodecanoato de etilo y 2,3-dihidrofarnesol (EFM), frente al disolvente pentano (Pe) y un control vacío (E) en B. c. reinas vírgenes florilegus. El eje y indica el número de individuos que eligen cualquiera de los aromas en 5 minutos. Los asteriscos indican significación estadística (P < 0,05) determinada mediante pruebas binomiales.

Se descubrió que las secuencias del gen de la subunidad I (COXI) de la citocromo c oxidasa del ADN mitocondrial extraídas del ADN derivado del esperma coincidían al 100 % con las secuencias registradas para cada una de las tres especies en el Banco de datos de ADN de Japón (LC695022, LC695025 y LC695021). Decodificamos con éxito la región ITS2 de las tres especies de abejorros, que exhibieron mutaciones específicas de cada especie. Las secuencias ITS2 de estas especies se registraron en el Banco de datos de ADN de Japón (LC769002 – LC769004). En particular, las secuencias de ITS2 obtenidas del ADN derivado de esperma en las espermatecas de varias reinas mostraron una identificación de especie diferente. La identificación de reinas cruzadas basada en la región ITS2 estuvo de acuerdo con los resultados del análisis de ADN mitocondrial.

Los resultados obtenidos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de cada especie y del análisis de secuencia fueron consistentes, revelando que el 9,9% de B. c. Las reinas florilegus en la península de Nemuro fueron inseminadas por machos invasores de B. terrestris. Además, el 4,4% de B. h. Las reinas sapporensis almacenaron esperma de los machos de B. terrestris en sus espermatecas. Por el contrario, no observamos ningún mestizaje entre las reinas de B. terrestris y los machos de especies nativas. Mediante disección confirmamos la ausencia de espermatozoides masculinos en las espermatecas de algunas reinas de las tres especies. Se encontró que la frecuencia de reinas no apareadas era del 13,5%, 2,8% y 2,8% para B. c. florilegus, B. h. sapporensis y B. terrestris respectivamente (Tabla 1).

Observamos picos dobles envueltos en los cromatogramas de las secuencias del gen COXI del ADN mitocondrial solo en las muestras de ADN extraídas de las espermatecas de B. h. reinas sapporensis. Los análisis de diagnóstico por PCR de estas muestras revelaron que el 1,6% de las espermatecas en B. h. Las reinas sapporensis contenían ADN de B. h. sapporensis y B. terrestris (Tabla 1 y Fig. 5).

(a) Imagen de gel electroforético de productos de PCR que utilizan cebadores comunes (1) y específicos (2–5) para Bombus cryptarum florilegus y B. terrestris. El gel muestra el marcador de ADN (M), muestras de ADN de la pata (1 y 2) y espermateca (3 y 4) de reinas de B. cf, y muestras de ADN de las patas de reinas de B. terrestris (5) (espermateca inseminada por macho conespecífico 3, y espermateca inseminada por macho aloespecífico de B. terrestris 4). (b) Imagen de gel electroforético de productos de PCR que utilizan cebadores comunes (6) y específicos (7-11) para B. hipócrita sapporensis y B. terrestris. El gel muestra el marcador de ADN (M), muestras de ADN de la pata (6 y 7) y espermateca (7-10) de reinas de B. hs, y muestras de ADN de las patas de reinas de B. terrestris (11) (espermateca inseminada por macho conespecífico 8, espermateca inseminada por machos conespecíficos y aloespecíficos de B. terrestris 9, y espermateca inseminada por macho aloespecífico de B. terrestris 10). (c) Imagen de gel electroforético de productos de PCR utilizando cebadores comunes (12) y específicos (13 y 14) para B. terrestris. El gel muestra el marcador de ADN (M), así como muestras de ADN de la pata (12 y 13) y la espermateca (14) de reinas de B. terrestris.

Nuestros análisis GC-EAD y pruebas de comportamiento proporcionaron evidencia de actividades cruzadas en feromonas sexuales entre B. terrestris y dos especies nativas de abejorros japoneses, B. h. sapporensis y B. c. florilegus. El atractivo del dodecanoato de etilo y el 2,3-dihidrofarnesol para las reinas vírgenes de B. terrestris, y sólo del dodecanoato de etilo para las reinas de B. terrestris, B. h. sapporensis y B. c. reinas florilegus. Marcar olores con olores producidos por la parte cefálica del LG es un comportamiento común entre los abejorros machos para atraer reinas de su misma especie17,18. Cada especie de abejorro tiene su propia mezcla específica de componentes que marcan el olor19. Aunque se cree que las feromonas marcadoras de olor desempeñan un papel en el aislamiento reproductivo, y que la presencia común de dodecanoato de etilo y 2,3-dihidrofarnesol en el LG conduce al cruzamiento entre especies nativas y no nativas13, en el mejor de los casos Hasta donde sabemos, el presente estudio es el primero en demostrar sus efectos sobre el comportamiento de las reinas. Nuestros hallazgos indican que los machos escapados de B. terrestris se aparean con reinas vírgenes de especies nativas en Nemuro, Hokkaido, Japón, lo que sugiere que la similitud en las feromonas sexuales masculinas entre abejorros nativos y no nativos es un factor clave en el apareamiento cruzado en el campo. Aunque una feromona sexual común sugiere la posibilidad de apareamiento cruzado entre B. h. sapporensis y B. c. florilegus, en este estudio no se observó cruce entre abejorros nativos. Especulamos que debido a diferencias en sus estaciones y estrategias reproductivas, las reinas vírgenes y los machos de las dos especies nativas de abejorros rara vez se encuentran en el campo.

Los análisis de ADN confirmaron la aparición de cruces entre especies nativas y no nativas en la península de Nemuro. Esto puede atribuirse a la contaminación de la muestra de ADN o a la posibilidad de que B. h. sapporensis y B. terrestris machos. Aunque templado B. c. las reinas florilegus son monándricas12, B. h. sapporensis y B. terrestris exhiben comportamientos monándricos y poliándricos en Japón20. Se ha informado que el 34,0% de B. h. Las reinas sapporensis son poliándricas. Curiosamente, los machos de abejorros nativos no se aparearon con las reinas de B. terrestris, posiblemente debido al dominio territorial de los machos de B. terrestris durante el comportamiento prematura que implicaba el marcado olfativo17,18. Esta interferencia reproductiva probablemente conduzca a una disminución de las poblaciones de abejorros nativos porque las reinas nativas que se aparean con B. terrestris no producen descendencia viable debido al desarrollo embrionario detenido de los huevos puestos10,11.

La disminución de las poblaciones nativas de abejorros en Japón, particularmente las de B. h. sapporensis y B. c. florilegus, ha ido aumentando debido a la rápida naturalización de B. terrestris, lo que ha resultado en la degradación del hábitat y la fragmentación de B. c. poblaciones de florilegus15. De hecho, un estudio reciente destacó la población fragmentada y la diversidad genética reducida de B. c. florilegus en las penínsulas de Nemuro y Notsuke14. Estos hallazgos, junto con nuestros resultados, subrayan la necesidad de medidas de conservación inmediatas para proteger a los abejorros nativos en la península de Nemuro. Además, los estudios futuros deberían considerar métodos de control para B. terrestris salvaje.

Reinas vírgenes y machos de B. h. sapporensis y B. c. florilegus se obtuvieron de colonias criadas en laboratorio, a menos que se especifique lo contrario. Estas colonias se establecieron utilizando reinas apareadas recolectadas en la península de Nemuro, isla de Hokkaido, Japón, entre junio de 2011 y 2012 (Fig. 6). Además, se compró una colonia comercial de B. terrestris L. de Agrisect Inc. (Inashiki, Ibaraki, Japón). Todas las colonias se criaron en una habitación con aire acondicionado a 28 °C en oscuridad constante con una dieta de polen y una solución de azúcar al 55%. Se realizaron análisis electrofisiológicos y pruebas de comportamiento utilizando machos de 7 días y reinas nuevas de 7 a 11 días.

Mapa de distribución de lugares de muestreo de especies de Bombus en Japón (a). Bombus cryptarum florilegus (bcf) se distribuye únicamente en las penínsulas de Nemuro y Notsuke (c), marcadas con líneas discontinuas. Bombus hipócrita sapporensis (bhs) se distribuye por la isla de Hokkaido (b), indicada por sombreado blanco y gris. Bombus terrestris (bt) está ampliamente presente y se está naturalizando en toda la isla de Hokkaido, como lo indica el sombreado gris. El área discontinua representa las distribuciones superpuestas de tres especies de Bombus. Mapa creado con la versión de prueba de Vactor (Autoridad de Información Geoespacial de Japón), https://maps.gsi.go.jp/vector/.

Entre 2009 y 2019, 641 reinas de B. c. florilegus, B. h. sapporensis y B. terrestris se recolectaron en la península de Nemuro, isla de Hokkaido, Japón (Fig. 6). Los detalles de la colección se proporcionan en la Tabla 1. Para el análisis de ADN, las reinas se conservaron en etanol al 99% y se almacenaron a -20 °C.

La preparación de muestras para el análisis de feromonas sexuales masculinas siguió el método descrito en nuestro estudio anterior13. Los abejorros machos se congelaron a -40 °C antes del análisis químico y la disección para obtener LG de la cabeza. Los LG se colocaron en viales de 4 ml, que se sellaron con papel de aluminio. Los componentes volátiles se extrajeron de los LG triturados mediante muestreo de espacio de cabeza de microextracción en fase sólida (SPME) durante 10 minutos. El dispositivo SPME (SUPELCO; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.) incluía una fibra de sílice fundida recubierta con polidimetilsiloxano (100 µm de espesor).

La técnica de registro de las respuestas antenales siguió nuestro estudio anterior21. Se utilizó el sistema GC-EAD (TAIYO Co., Tsukuba, Japón) para investigar las respuestas antenales de B. terrestris, B. h. sapporensis y B. c. florilegus reinas vírgenes a extractos de LG masculinos de individuos conespecíficos y aloespecíficos. Los volátiles se detectaron y separaron utilizando una columna DB-5MS equipada con un sistema GC-7890A (Agilent Technologies, EE. UU.). La temperatura de la columna se fijó inicialmente en 120 °C y luego se aumentó a 250 °C a una velocidad de 10 °C/min. Se usó un flujo de helio (6,5 ml/min) en un puerto de inyector splitless (250 °C) y un puerto detector de ionización de llama (300 °C) con una combinación de gas hidrógeno y flujo de aire (30 ml/min y 400 ml/min, respectivamente).

Se conectaron a un amplificador electrodos de plata llenos de gel conductor (Aquasonic; Parker Laboratories, EE. UU.). Se extrajeron antenas de nuevas reinas vivas con pinzas y se colocaron entre los electrodos de plata. Cada análisis se repitió cinco veces. Los compuestos que provocaban respuestas en las antenas se consideraron compuestos activos en EAD.

Para identificar los compuestos activos de EAD, los extractos de LG se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas siguiendo el mismo método utilizado en los análisis de GC-EAD. Los picos detectados se compararon con la base de datos de espectros de masas (Wiley 229) y los presuntos compuestos se identificaron comparando los tiempos de retención y los espectros de masas con los respectivos estándares químicos: 97% de dodecanoato de etilo (Sigma-Aldrich) y 97% de 2,3-dihidrofarnesol ( TAIYO Co.). La identificación del 2,3-dihidrofarnesal se basó en una comparación de los espectros de masas obtenidos con los de la biblioteca Wiley y con datos publicados anteriormente16.

Los bioensayos de abejorros reina, utilizados para evaluar su respuesta a extractos de LG macho conespecíficos o aloespecíficos, siguieron los métodos descritos anteriormente21,22. En el experimento de comportamiento, se utilizó un olfatómetro de tubo en Y que comprendía un único brazo largo (longitud, 35,0 cm; diámetro, 3,5 cm) y dos brazos cortos (longitud, 15,0 cm; diámetro, 3,5 cm). Se conectaron cilindros de vidrio (longitud, 10,0 cm; diámetro, 2,5 cm) que contenían las sustancias de prueba al extremo de los brazos más cortos mediante un tubo de silicona. Las sustancias de prueba incluyeron 2 μL de dodecanoato de etilo (ED) al 0,001%, 2,3-dihidrofarnesol (DF), una mezcla de dodecanoato de etilo y 2,3-dihidrofarnesol (EFM) disueltos en pentano, así como extractos LG de B. terrestris (BtL), B. h. sapporensis (BhsL), B. c. florilegus (BcfL) y pentano solo. Estas sustancias se aplicaron a un trozo de papel de filtro en el cilindro de vidrio. Los extractos de LG se obtuvieron sumergiendo LG macho en 1 ml de pentano durante 20 min. Ambos cilindros de vidrio se conectaron a una bomba de aire a través de tubos de silicona de igual longitud, con aire forzado dentro de cada cilindro a una velocidad de 3 ml/min a través de una única entrada.

En total, 20, 16 y 10 reinas vírgenes de B. terrestris, B. h. sapporensis y B. c. florilegus, respectivamente, se incluyeron en los bioensayos. Cada reina fue liberada en una cámara de plástico (15 × 10 × 10 cm) conectada al brazo largo del tubo en Y. Si una abeja elegía uno de los brazos más cortos en 5 minutos, se consideraba que había "elegido" el olor correspondiente. Las abejas que no tomaron una decisión dentro de este plazo fueron excluidas del análisis. La secuencia experimental consistió en elegir entre vacío (E) versus pentano, seguido de BtL versus pentano, BhsL versus pentano, BcfL versus pentano, ED versus pentano, DF versus pentano y EFM versus pentano. Para evitar un posible sesgo hacia un brazo específico del tubo en Y, las posiciones del tratamiento (BtL, BhsL, BcfL, ED, DF y EFM) y el control (pentano) se cambiaron después de cada ejecución. El diseño del aparato de tubo en Y se muestra en la figura complementaria 7.

Los datos obtenidos del experimento del tubo en Y se analizaron mediante la prueba binomial. Los valores de p para comparaciones múltiples se corrigieron utilizando el método de Holm.

El ADN genómico de las reinas se extrajo de las patas traseras utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN). El esperma presente en las espermatecas de las reinas se recogió y procesó como se describió anteriormente23. Las espermatecas se diseccionaron en solución salina tamponada con fosfato 1x y los grupos de espermatozoides se separaron de las membranas utilizando alfileres de insectos. El ADN genómico del macho que se apareó con una reina se extrajo de estos grupos de espermatozoides utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN).

Los fragmentos del gen COXI mitocondrial, comúnmente utilizado como región de código de barras de ADN, se amplificaron mediante PCR utilizando el par de cebadores COIF (HCO2198_t1: 5ʹ-TGTAAAACGACGGCCAGTGGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3ʹ) y COIR (LCO1490_t1: 5ʹ-CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3ʹ). 24. Las amplificaciones por PCR consistieron en un paso de desnaturalización inicial a 98 °C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 s, hibridación a 50 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 1 min y una extensión final a 72 °C por 10 min. Se utilizó ADN polimerasa ExTaq (Takara, Otsu, Japón) para las amplificaciones en un ciclador térmico (Takara). Los productos de la PCR se purificaron utilizando ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH). Las reacciones de secuenciación de ciclos se realizaron utilizando ambos cebadores y BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems). Después de la purificación del producto, la secuenciación se realizó utilizando un secuenciador ABI 3130xl (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas se alinearon utilizando el programa GENETYX (GENETYX, Tokio, Japón) y se realizó una búsqueda BLAST para análisis de homología.

Cópula interespecífica entre B. c. florilegus, B. h. sapporensis y B. terrestris se confirmó mediante PCR y electroforesis. La PCR de diagnóstico se realizó utilizando cebadores comunes de abejorro y específicos de especie diseñados en base a las secuencias del gen COI de B. c. florilegus, B. h. sapporensis y B. terrestris, respectivamente25 (Tabla 2). El par de cebadores universales para códigos de barras de ADN24 sirvió como control positivo para la evaluación de la calidad del ADN. El ADN utilizado en el análisis de secuencia sirvió como ADN molde. La PCR se realizó utilizando los siguientes parámetros del ciclo: un paso de desnaturalización inicial de 2 min a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 °C, 30 s a 50–58 °C y 60 s a 72 °C. El paso de elongación final se extendió a 10 min. Se utilizó ADN polimerasa HiDi (myPOLS Biotec, Konstanz, Alemania) en un ciclador térmico (Takara). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa PrimeGel ™ Agarose PCR-Sieve (Takara) y se visualizaron bajo luz ultravioleta utilizando la solución Midorigreen Direct DNA Stain (NIPPON Genetics, Tokio, Japón).

Para determinar la presencia de reinas de apareamiento interespecíficas, también secuenciamos la región ITS2 del ADN nuclear. Se analizaron reinas seleccionadas al azar que se determinó que se habían sometido a apareamiento interespecífico según la PCR de diagnóstico para el ADN mitocondrial, junto con 20 reinas por especie que se determinó que se habían sometido a apareamiento intraespecífico. La región ITS2 se secuenció utilizando dos cebadores y condiciones experimentales desarrolladas previamente26. Las longitudes de secuencia ITS2 de B. h. sapporensis, B. c. florilegus y B. terrestris tenían aproximadamente 2000 pb. Los fragmentos de PCR se ligaron en un vector pUC19 y se transformaron en células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara, Otsu, Japón). En total, se recogieron 360 colonias recombinantes y se suspendieron individualmente en 20 µl de tampón TE. Los insertos se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores M13-RV y M13–47 para el sitio de multiclonación de pUC19 (Takara, Otsu, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diseñaron tres cebadores internos comunes a estos abejorros para la secuenciación (BombusITS2_588: 5ʹ-GCAGGTTTTCGATGAGCACG-3ʹ; BombusITS2_1103: 5ʹ-ACGTTCGTCGGAAATCGTAC-3ʹ; BombusITS2_1474: 5ʹ-GTTGGTCATCCCATGCCTTT-3ʹ). El método de análisis de secuenciación fue el mismo que el utilizado para secuenciar el gen COXI del ADN mitocondrial, como se describió anteriormente.

Las secuencias de ADN mitocondrial de tres especies de Bombus están disponibles en el Banco de datos de ADN de Japón: Bombus cryptarum: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695021/?filetype=html; Bombus hipócrita: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695025/?filetype=html; Bombus terrestris: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC695022/?filetype=html. Además, las secuencias de ADN nuclear ITS2 de tres especies de Bombus están disponibles en el Banco de datos de ADN de Japón: Bombus cryptarum: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769002/?filetype=html; Bombus hipócrita: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769003/?filetype=html; Bombus terrestris: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/getentry/na/LC769004/?filetype=html.

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Centro de Investigación Científica de las Abejas, Universidad de Tamagawa, 6-1-1, Tamagawagakuen, Machida, Tokio, Japón

Ryohei Kubo y Masato Ono

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Kyoto Sangyo, Kamigamo, Motoyama, Kita-Ku, Kioto, Japón

Yuine Asanuma, Erina Fujimoto, Hisashi Okuyama y Jun-ichi Takahashi

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RK, YA y JT escribieron el texto principal del manuscrito y HO y MO prepararon todas las figuras y complementaron los datos. RK y MO hicieron el análisis químico. YA, EF, HO y JT realizaron análisis de ADN. Todos los autores realizaron una investigación de campo y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jun-ichi Takahashi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kubo, R., Asanuma, Y., Fujimoto, E. et al. Cruzamiento entre el abejorro alienígena Bombus terrestris y dos abejorros japoneses nativos, B. hipócrita sapporensis y B. cryptarum florilegus, en la península de Nemuro, Japón. Representante científico 13, 11506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38631-7

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Recibido: 28 de marzo de 2023

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 17 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38631-7

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